摘要

彌漫性軸索損傷（Diffuse Axonal Injury, DAI）是重型顱腦創(chuàng)傷中致殘率和死亡率極高的病理類型，其早期診斷和預(yù)后評(píng)估缺乏特異性生物標(biāo)志物。本研究采用iTRAQ（相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記）聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)，對(duì)DAI患者及對(duì)照組的腦脊液/血清樣本進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選差異表達(dá)蛋白，并通過(guò)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）、蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析構(gòu)建聚類網(wǎng)絡(luò)，鑒定與DAI發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的候選生物標(biāo)志物。研究結(jié)果為DAI的分子機(jī)制解析及臨床診斷標(biāo)志物的開發(fā)提供了重要依據(jù)。

1. 引言

彌漫性軸索損傷是創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的一種嚴(yán)重亞型，主要由旋轉(zhuǎn)加速-減速剪切力導(dǎo)致神經(jīng)元軸索廣泛損傷。DAI患者常表現(xiàn)為持續(xù)昏迷，且常規(guī)影像學(xué)檢查（CT/MRI）在早期往往陰性，臨床診斷高度依賴醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)，缺乏客觀的分子指標(biāo)。因此，尋找高靈敏度、高特異性的DAI生物標(biāo)志物具有重要的臨床價(jià)值。

iTRAQ技術(shù)作為一種高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)比較多達(dá)8種不同樣本的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度，具有標(biāo)記效率高、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物標(biāo)志物的篩選。單純依賴差異倍數(shù)和P值篩選標(biāo)志物易忽略蛋白間的協(xié)同變化及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。聚類網(wǎng)絡(luò)分析（如WGCNA和PPI網(wǎng)絡(luò)）可從系統(tǒng)生物學(xué)層面揭示蛋白模塊與臨床表型的關(guān)聯(lián)，提高標(biāo)志物的可信度。

2. 材料與方法

2.1 樣本收集

選取重度顱腦創(chuàng)傷患者（DAI組，n=30）及健康對(duì)照（n=30）的腦脊液或外周血樣本。DAI診斷依據(jù)臨床特征、GCS評(píng)分及MRI影像學(xué)表現(xiàn)（SWI序列顯示彌漫性微出血灶）。所有樣本采集后立即離心分裝，-80°C保存。

2.2 蛋白提取與iTRAQ標(biāo)記

樣本經(jīng)裂解、還原烷基化、胰蛋白酶酶切后，采用8標(biāo)iTRAQ試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。各組樣本等量混合后，經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）分級(jí)，再進(jìn)行LC-MS/MS分析（Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀）。

2.3 數(shù)據(jù)處理與差異蛋白篩選

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Proteome Discoverer軟件檢索UniProt人類數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：可信度≥95%，至少包含2個(gè)獨(dú)特肽段，差異倍數(shù)（FC）>1.5或<0.67，且P<0.05。

2.4 聚類網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

• WGCNA分析：將差異蛋白表達(dá)量導(dǎo)入R語(yǔ)言WGCNA包，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，識(shí)別與DAI臨床評(píng)分（GCS、Rotterdam CT評(píng)分）顯著相關(guān)的模塊。
• PPI網(wǎng)絡(luò)：通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape軟件進(jìn)行可視化及Hub基因篩選（MCC、Degree算法）。
• 功能富集：使用DAVID和Metascape進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

3. 結(jié)果

3.1 差異表達(dá)蛋白鑒定

共鑒定到6,842個(gè)可信蛋白，其中DAI組相較對(duì)照組顯著上調(diào)蛋白217個(gè)，下調(diào)蛋白184個(gè)。上調(diào)蛋白包括神經(jīng)絲輕鏈（NFL）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、S100B、髓鞘堿性蛋白（MBP）等；下調(diào)蛋白涉及突觸囊泡循環(huán)、線粒體氧化磷酸化相關(guān)蛋白。

3.2 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與臨床關(guān)聯(lián)

WGCNA識(shí)別出12個(gè)共表達(dá)模塊。其中，turquoise模塊（包含1,024個(gè)蛋白）與GCS評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.72, P=1.3e-8），brown模塊（687個(gè)蛋白）與Rotterdam CT評(píng)分正相關(guān)（r=0.65, P=4.1e-6）。turquoise模塊富集于軸索運(yùn)輸、突觸信號(hào)和細(xì)胞骨架重構(gòu)通路，其核心Hub蛋白為NEFL、NEFM、MAPT和UCHL1。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與Hub蛋白

PPI網(wǎng)絡(luò)包含389個(gè)節(jié)點(diǎn)和2,114條邊。通過(guò)MCC算法篩選出前15個(gè)Hub蛋白，包括NEFL、NEFM、GFAP、S100B、ENO2、SYN1、GAPDH、ATP5B等。這些Hub蛋白主要富集于神經(jīng)退行性疾病通路、PI3K-Akt信號(hào)通路及氧化磷酸化通路。

3.4 候選生物標(biāo)志物組合

將WGCNA核心模塊中的Hub蛋白與PPI網(wǎng)絡(luò)Hub蛋白取交集，獲得7個(gè)重疊蛋白：NEFL、NEFM、GFAP、S100B、UCHL1、ENO2和SYN1。受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示，這7個(gè)蛋白聯(lián)合診斷DAI的AUC可達(dá)0.94（95%CI：0.88–0.99），優(yōu)于單一指標(biāo)（NFL AUC=0.86，GFAP AUC=0.82）。

4. 討論

損傷軸索釋放的結(jié)構(gòu)蛋白（NFL、NEFM、MBP）可直接反映軸索損傷程度，而星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物（GFAP、S100B）則體現(xiàn)繼發(fā)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)合iTRAQ定量結(jié)果與聚類網(wǎng)絡(luò)分析，不單純依賴差異倍數(shù)，而是從網(wǎng)絡(luò)調(diào)控角度篩選出更穩(wěn)定的標(biāo)志物組合。

WGCNA模塊與GCS評(píng)分的高度關(guān)聯(lián)提示，軸索運(yùn)輸和突觸信號(hào)通路相關(guān)蛋白的協(xié)同下調(diào)可能是DAI后意識(shí)障礙的分子基礎(chǔ)。PPI網(wǎng)絡(luò)中的Hub蛋白不僅具有診斷價(jià)值，還可能作為潛在治療靶點(diǎn)。其中UCHL1和ENO2此前在TBI中報(bào)道較少，但其在本研究網(wǎng)絡(luò)中處于連接節(jié)點(diǎn)位置，值得進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究存在一定局限：樣本量有限，且腦脊液與血清標(biāo)志物濃度可能存在差異；iTRAQ標(biāo)記的批間效應(yīng)可能影響低豐度蛋白的定量準(zhǔn)確性。未來(lái)的方向應(yīng)包括PRM/MRM靶向驗(yàn)證以及多中心大樣本隊(duì)列的外部驗(yàn)證。

5. 結(jié)論

通過(guò)iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合WGCNA和PPI聚類網(wǎng)絡(luò)分析，本研究篩選出以NEFL、NEFM、GFAP、S100B、UCHL1、ENO2、SYN1為核心的DAI候選生物標(biāo)志物網(wǎng)絡(luò)，為DAI的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)及分子機(jī)制研究提供了新的視角和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。該策略亦可推廣至其他創(chuàng)傷性腦損傷亞型的標(biāo)志物篩選研究。

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